En mi caso, necesitaba tener dos imágenes .iso conectadas como dispositivos ópticos durante una instalación. Descubrí que después de agregar la segunda imagen al controlador IDE, VirtualBox dejó de reconocer la primera imagen como de arranque.
Después de muchas pruebas y errores, pude arrancar una vez más seleccionando Configuración> Almacenamiento, seleccionando la imagen .iso de arranque y cambiando sus atributos a IDE Primary Slave .
Para lo que vale, también tuve que cambiar los atributos del otro dispositivo de imagen .iso a IDE Secundario antes de que la opción Esclavo primario estuviera disponible para la imagen de arranque. Me imagino que el orden en que agrega las imágenes al árbol de almacenamiento puede determinar qué atributos se les asignan.